一、ELISA的基本原理
ELISA（Enzyme-Linkedimmunosorbent assay）的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活力。在測(cè)定時(shí)，把待測(cè)樣本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，所以可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化速率很高，所以可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
二、ELISA的類型
ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：①固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent） ;②酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物（conjugate）;③酶反應(yīng)的底物。
根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型：
1．雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，操作步驟如下圖所示：
（1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
（2）加待測(cè)樣本，溫育反應(yīng)樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
（3）加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與樣本中待測(cè)抗原的量相關(guān)。
（4）加底物顯色固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測(cè)得樣本中抗原的量。在檢驗(yàn)中，此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原。只要獲得針對(duì)待測(cè)抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性，而且可以將待測(cè)樣本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，作一步檢測(cè)。
2．雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中待測(cè)樣本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。
3．間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，所以稱為間接法，如下圖所示。操作步驟如下：
片
（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
（2）加稀釋的待測(cè)血清，溫育反應(yīng)血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成分在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標(biāo)抗體可用酶標(biāo)抗人IgG以檢測(cè)總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中待測(cè)抗體的量相關(guān)。
（4）加底物顯色間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗(yàn)的特異性。間接法中一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。血清中待測(cè)的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如，牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測(cè)過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40～1:200），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。
4．競爭法測(cè)抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為樣本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。樣本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體越少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后與固相抗原競爭結(jié)合。另一種模式為將樣本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)，如下圖所示。
5．競爭法測(cè)抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競爭法模式。其原理是樣本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。樣本中抗原量含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，最后的顯色也越淺。
小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。
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